Флуоресцентная микроскопия в онкологических исследованиях

Опухолевая клетка не выглядит опухолевой. В окрашенном гематоксилином срезе патолог опирается на косвенные признаки — соотношение ядра и цитоплазмы, атипию, митозы. Но вопрос «есть ли в этой клетке амплификация конкретного гена» светлое поле не решает в принципе.

Флуоресцентная микроскопия отвечает на такие вопросы напрямую: она заставляет светиться ровно ту молекулу или последовательность, которая интересует исследователя. Ниже — обзор того, как метод работает в онкологии, и где проходят границы его применимости.

Роль флуоресцентной микроскопии в диагностике рака

Сразу оговорим рамку. Микроскоп не ставит диагноз. Он формирует изображение, которое интерпретирует специалист; клиническое решение принимается на основании гистологического заключения, молекулярных данных, визуализации и клинической картины в совокупности. Всё сказанное ниже относится к исследовательской и лабораторной практике, а не к рекомендациям по лечению.

В этой рамке флуоресценция даёт то, чего не даёт рутинная окраска, — молекулярную специфичность. Антитело, конъюгированное с флуорофором, связывается со своим антигеном. Зонд ДНК гибридизуется со своей последовательностью. На тёмном фоне видно, есть сигнал или нет.

Основные направления, в которых метод применяется:

• Иммунофлуоресценция. Выявление белковых маркеров в клетках и тканях.
• FISH — флуоресцентная гибридизация in situ. Оценка числа копий гена, поиск транслокаций и перестроек непосредственно в срезе или мазке.
• Оценка пролиферации. Маркеры клеточного цикла показывают долю делящихся клеток.
• Исследования клеточных линий. Работа с культурами опухолевых клеток при подборе воздействий in vitro.
• Микроокружение опухоли. Многоцветное окрашивание позволяет одновременно увидеть опухолевые клетки, сосуды и иммунные клетки.

Требования к оптике здесь жёстче, чем в рутинной микроскопии. Объективы с высокой числовой апертурой — а именно апертура определяет, какая доля испущенных фотонов попадёт в тракт при слабом сигнале, — и корректируют хроматические и сферические аберрации, устраняя кривизну поля.

Применение метода для исследования опухолевых клеток и тканей

FISH-анализ — характерный пример задачи, где качество прибора напрямую превращается в качество вывода. Исследователь считает сигналы двух зондов в ядре: один помечает исследуемый локус, второй служит внутренним контролем. Отношение числа сигналов и говорит об амплификации.

Что здесь может пойти не так по вине оптики. Если при смене фильтра изображение смещается хотя бы на доли микрона, сигналы разных каналов ложно совмещаются или, наоборот, расходятся. Вывод о совместной локализации оказывается артефактом юстировки, а не биологией. Поэтому фильтры для флуоресценции юстируют, а их качественное покрытие устраняет до 99 % фонового излучения, обеспечивая высокую чувствительность и точный цветовой анализ.

Вторая частая проблема — путаница в архиве. Через полгода трудно вспомнить, каким объективом и с каким набором фильтров снят кадр. Кодированные револьверные головки в совокупности с турелью для флуоресцентных фильтров позволяют определять, какой объектив с какой позицией турели использовался в любой момент исследования, и эти данные записываются в метаданные изображения.

Восьмипозиционная турель с быстрой сменой фильтра и широкий выбор тринокулярных тубусов с выходом на камеру делают платформу пригодной для многоцветных протоколов. Подобрать конфигурацию под конкретный протокол — набор фильтров, объективы, камеру — помогают специалисты, которые предложат флуоресцентный микроскоп в нужном исполнении, а также помогут сравнить решения разных производителей.

Использование флуорофоров для выявления онкомаркеров

Подбор флуорофора — методическая, а не оптическая задача, но от неё зависит, увидит ли микроскоп сигнал.

Ключевые соображения:

• Разнесение спектров. При многоцветном окрашивании эмиссия одного красителя частично попадает в канал соседнего. Возникает ложная колокализация: кажется, что два маркера в одной клетке, а на деле сигнал «протёк» между каналами. Красители подбирают с максимально разнесёнными спектрами эмиссии.
• Яркость и фотостабильность. Слабый маркер требует яркого и устойчивого флуорофора, иначе сигнал выцветет раньше, чем будет снят кадр.
• Автофлуоресценция ткани. Коллаген, эластин и особенно липофусцин в опухолевой ткани светятся сами, преимущественно в зелёной области. Слабую метку в этом же диапазоне разглядеть не удастся — её смещают в красную или дальнюю красную область.
• Фиксация. Формалин усиливает автофлуоресценцию, а часть эпитопов маскирует; парафиновые срезы требуют демаскировки антигена.

Оптика должна соответствовать выбранному красителю. Объективы с полностью скомпенсированными сферическими и хроматическими аберрациями работают в диапазоне от ультрафиолета до ближнего инфракрасного и специально чувствительны к спектру эмиссии люминесцентных красителей. Другие серии объективов сохраняют хорошую пропускаемость до ближней инфракрасной области, дают плоское изображение при высокой светопропускаемости.

Контроли обязательны: препарат без первичного антитела, препараты с одиночным окрашиванием для оценки перетекания сигнала, срез без метки для оценки автофлуоресценции. Без них многоцветное изображение красиво, но недоказательно.

Техника и анализ сигналов при исследовании живых клеток

Работа с живой культурой опухолевых клеток добавляет ограничение, которого нет у фиксированного препарата: свет